蛋白質工学研究室wiki

シーケンス


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<シーケンス確認>
★ プラスミドの配列を確認する

PCR

1.プラスミド調整
Milli Q       5 μl 
プラスミド    1 μl(0.2 μgくらい)
total          6 μl
※テンプレート量は50~70 fmolが目安。プラスミド量が適性ならばシーケンス解析時の最初のピークが20 min前後で現れる。濃度が濃すぎると30 minくらいになる(らしい)。


2.プレヒート処理(PCR産物で行う際は必要ない)
サーマルサイクラー使用
96℃  1 min  1 cycle
25℃    ∞    
でプレヒート。終了後、軽く遠心して水滴を落とす。


3. PCR用サンプル調整(??要確認??)
Master mix  (on ice)     2μl
5×Sequence buffer       1μl
Primer (1.6 pmol/μl)    1μl 
×サンプル数分(+α)
を作製し、先ほどのプラスミドMix(6μl)に4μlずつ分注する。これでトータル10μl。


4. dideoxy 伸長反応
96℃  5 min   1 cycle
96℃    30sec
50℃    15sec
60℃   2~4 min 35 cycle(30cycleでも多分大丈夫)
15℃     ∞
でPCRを行う。

精製

1.エタ沈
3M     CH3COONa   1μl
100mM  EDTA       1μl
Glycogen (-20℃保存)  0.5 μl
×サンプル数分(+α)
を調整。1.5mlエッペンに2.5μlずつ分注。
伸長反応液10μlを加える。これでトータル12.5μl。

2.
  • 20℃ 100% EtOH 30μlを加え、ボルテックス後、遠心(15000rpm, 30 min)。
※ここの工程は1 min以内に行う。

3. 上清をピペットマンで除去

4. wash×2
 -20℃ 70% EtOH 100μlを加え(混ぜない)、遠心(15000rpm, 2 min)。上清をピペットマンで除去。を、全部で二回やる。

5. バキューム乾燥遠心3~5 min
※乾燥遠心機は温度が上がらないように、Drying Rateは必ずLowにする。高温厳禁。引き出しの中で10~15 min静置でもいいらしい?

6. sample loading solution 25μlに溶かす。ペレットがなくなるまでピペッティング。根性。
※ボルテックス 1 min、その後軽くピペッティング、、、でもいけるという噂あり

7. サンプルプレート(白で半透明の底がとがった96穴プレート)のレーン(例 1-A, 1-B, 1-C, 1-D, 1-E, 1-F, 1-G, 1-H のように一回で横一列使用)にサンプル25μlアプライ。ブランクにはsample loading solution 25μlをアプライ。

8. サンプルの上にミネラルオイル(BECHMAN COULTER MINERAL OIL)を一滴滴下。側面に沿わせるようにする。ブランクにも一応やっておく。

9. バッファープレート(底が平らで透明なプレート)のサンプルに対応するレーンにバッファー(4℃保存のCEQ SEPARATION BUFFER BECHMAN COULTER)を8分目まで滴下。


遺伝子解析システムCEQ 8000 (Beckman Coulter) にて配列解析。


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