蛋白質工学研究室wiki

コロニーPCR


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<コロニーPCR>
2×Go taq master mix   全量×1/2 ul
プライマー1            ul
プライマー2            ul
ミリQ                  ul
total コロニー数(+α)×20 ulになるように調製する
   ↓
8連チューブに20 ulずつ分注する
   ↓
LBAプレートを一枚用意する
   ↓
前日のプレートから白コロニーを爪楊枝でつつき、Go taq溶液に植える
同時にLBAプレートにも植える(マスタープレートの作製)
   ↓
プレートは37℃でo/n培養
8連チューブはPCRにかける
条件
94℃  3 min               
94℃ 30 sec
55℃ 30 sec     30サイクル
72℃   min               
72℃ 3 min
15℃   ∞



<確認泳動>
★ 増幅したDNA断片を電気泳動し、サイズを確認する
アガロース0.4 gを軽量し、TAEバッファー40 ulを加えて電子レンジで温めて溶かす
   ↓
しばらく冷ました後エチジウムブロマイド(EtBr、発がん物質、取り扱い注意)を4 ul加える
   ↓
型に入れて固める
   ↓
PCR産物を各5 ulアプライして電気泳動する(120V、25 min)
   ↓
UVランプをあてて確認する


<少量培養>
★ 目的のプラスミドを保持していると思われる大腸菌を再培養して増やす
クリーンベンチ内で
LB試験管培地 4 ml
Ampicilin 4 ul
を調製し、そこにレプリカプレートから大腸菌を植菌する(今回は前日作製した大元のプレートからつつく)
   ↓
37℃、o/n培養


<ミニプレ>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega)
★ 培養した大腸菌からプラスミドを抽出し精製する
培養液をエッペンにアプライ、15,000rpm、3min遠心、上清除去
   ↓
Cell Resuspension Solution(赤)250μl アプライ、ボルテックスなどで懸濁
   ↓
Cell Lysis Solution(緑) 250μlアプライ、穏やかに3~4回転倒Mix
   ↓
室温5minインキュベート
   ↓
Alkaline Protease Solution(青小)10μlアプライ、穏やかに3~4回転倒Mix
   ↓
室温5minインキュベート
   ↓
Neutralization Solution(青大)350μlアプライ、穏やかに3~4回転倒Mix
   ↓
15,000rpm、10min遠心
   ↓
上清をカラムにアプライ
   ↓
15,000rpm、1min遠心、スルー除去
   ↓
Column Wash Solution(黒)750μlアプライ
   ↓
15,000rpm、1min遠心、スルー除去
   ↓
Column Wash Solution(黒)250μlアプライ
   ↓
15,000rpm、1min遠心、スルー除去
   ↓
15,000rpm、3minカラ遠心
   ↓
スピンカラムを新しいエッペンにセットし、Nuclease Free Water 30μlアプライ、1min静置
   ↓
15,000rpm、1min遠心、スルー回収
   ↓
  • 30℃保存












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