「シーケンス」(2011/04/21 (木) 11:06:01) の最新版変更点
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<シーケンス確認>
★ プラスミドの配列を確認する
***PCR
1.プラスミド調整
Milli Q 5 μl
プラスミド 1 μl(0.2 μgくらい)
total 6 μl
※テンプレート量は50~70 fmolが目安。プラスミド量が適性ならばシーケンス解析時の最初のピークが20 min前後で現れる。濃度が濃すぎると30 minくらいになる(らしい)。
2.プレヒート処理(PCR産物で行う際は必要ない)
サーマルサイクラー使用
96℃ 1 min 1 cycle
25℃ ∞
でプレヒート。終了後、軽く遠心して水滴を落とす。
3. PCR用サンプル調整
Master mix (on ice) 2μl
5×Sequence buffer 1μl
Primer (1.6 pmol/μl) 1μl
×サンプル数分(+α)
を作製し、先ほどのプラスミドMix(6μl)に4μlずつ分注する。これでトータル10μl。
4. dideoxy 伸長反応
96℃ 5 min 1 cycle
96℃ 30sec
50℃ 15sec
60℃ 2~4 min 35 cycle(30cycleでも多分大丈夫)
15℃ ∞
でPCRを行う。
***精製
1.エタ沈
3M CH3COONa 1μl
100mM EDTA 1μl
Glycogen (-20℃保存) 0.5 μl
×サンプル数分(+α)
を調整。1.5mlエッペンに2.5μlずつ分注。
伸長反応液10μlを加える。これでトータル12.5μl。
2.
-20℃ 100% EtOH 30μlを加え、ボルテックス後、遠心(15000rpm, 30 min)。
※ここの工程は1 min以内に行う。
3. 上清をピペットマンで除去
4. wash×2
-20℃ 70% EtOH 100μlを加え(混ぜない)、遠心(15000rpm, 2 min)。上清をピペットマンで除去。を、全部で二回やる。
5. バキューム乾燥遠心3~5 min
※乾燥遠心機は温度が上がらないように、Drying Rateは必ずLowにする。高温厳禁。引き出しの中で10~15 min静置でもいいらしい?
6. sample loading solution 25μlに溶かす。ペレットがなくなるまでピペッティング。根性。
※ボルテックス 1 min、その後軽くピペッティング、、、でもいけるという噂あり
7. サンプルプレート(白で半透明の底がとがった96穴プレート)のレーン(例 1-A, 1-B, 1-C, 1-D, 1-E, 1-F, 1-G, 1-H のように一回で横一列使用)にサンプル25μlアプライ。ブランクにはsample loading solution 25μlをアプライ。
8. サンプルの上にミネラルオイル(BECHMAN COULTER MINERAL OIL)を一滴滴下。側面に沿わせるようにする。ブランクにも一応やっておく。
9. バッファープレート(底が平らで透明なプレート)のサンプルに対応するレーンにバッファー(4℃保存のCEQ SEPARATION BUFFER BECHMAN COULTER)を8分目まで滴下。
遺伝子解析システムCEQ 8000 (Beckman Coulter) にて配列解析。
http://www.beckmancoulter.com/literature/Bioresearch/390218aa.pdf
<シーケンス確認>
★ プラスミドの配列を確認する
***PCR
1.プラスミド調整
Milli Q 5 μl
プラスミド 1 μl(0.2 μgくらい)
total 6 μl
※テンプレート量は50~70 fmolが目安。プラスミド量が適性ならばシーケンス解析時の最初のピークが20 min前後で現れる。濃度が濃すぎると30 minくらいになる(らしい)。
2.プレヒート処理(PCR産物で行う際は必要ない)
サーマルサイクラー使用
96℃ 1 min 1 cycle
25℃ ∞
でプレヒート。終了後、軽く遠心して水滴を落とす。
3. PCR用サンプル調整(??要確認??)
Master mix (on ice) 2μl
5×Sequence buffer 1μl
Primer (1.6 pmol/μl) 1μl
×サンプル数分(+α)
を作製し、先ほどのプラスミドMix(6μl)に4μlずつ分注する。これでトータル10μl。
4. dideoxy 伸長反応
96℃ 5 min 1 cycle
96℃ 30sec
50℃ 15sec
60℃ 2~4 min 35 cycle(30cycleでも多分大丈夫)
15℃ ∞
でPCRを行う。
***精製
1.エタ沈
3M CH3COONa 1μl
100mM EDTA 1μl
Glycogen (-20℃保存) 0.5 μl
×サンプル数分(+α)
を調整。1.5mlエッペンに2.5μlずつ分注。
伸長反応液10μlを加える。これでトータル12.5μl。
2.
-20℃ 100% EtOH 30μlを加え、ボルテックス後、遠心(15000rpm, 30 min)。
※ここの工程は1 min以内に行う。
3. 上清をピペットマンで除去
4. wash×2
-20℃ 70% EtOH 100μlを加え(混ぜない)、遠心(15000rpm, 2 min)。上清をピペットマンで除去。を、全部で二回やる。
5. バキューム乾燥遠心3~5 min
※乾燥遠心機は温度が上がらないように、Drying Rateは必ずLowにする。高温厳禁。引き出しの中で10~15 min静置でもいいらしい?
6. sample loading solution 25μlに溶かす。ペレットがなくなるまでピペッティング。根性。
※ボルテックス 1 min、その後軽くピペッティング、、、でもいけるという噂あり
7. サンプルプレート(白で半透明の底がとがった96穴プレート)のレーン(例 1-A, 1-B, 1-C, 1-D, 1-E, 1-F, 1-G, 1-H のように一回で横一列使用)にサンプル25μlアプライ。ブランクにはsample loading solution 25μlをアプライ。
8. サンプルの上にミネラルオイル(BECHMAN COULTER MINERAL OIL)を一滴滴下。側面に沿わせるようにする。ブランクにも一応やっておく。
9. バッファープレート(底が平らで透明なプレート)のサンプルに対応するレーンにバッファー(4℃保存のCEQ SEPARATION BUFFER BECHMAN COULTER)を8分目まで滴下。
遺伝子解析システムCEQ 8000 (Beckman Coulter) にて配列解析。
http://www.beckmancoulter.com/literature/Bioresearch/390218aa.pdf
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